Главная


Узнайте как превосходную эту купить мото косу.

Иммуноферментный анализ. Методика

Последующее описание основывается на гетерогенном ИФА применительно к определению HBs-антигена двойным «сэндвич-методом».

Материалы и оборудование

Для работы необходимы: полистироловые пробирки или планшеты (Polypast, Хальберштадт), анти-НВs-гамма-глобулин морской свинки (первые антитела), анти-НВs-гамма-глобулин кролика (вторые антитела), бараньи антитела к IgG кролика, меченые пероксидазой (фракция IgG), HBs-стандарт (Austria II, Abbott lab., Чикаго), HBs-позитивная сыворотка (вторичный стандарт), ФСБ (0,1 М фосфатный буфер с рН 7,2, 1 М NaCl), человеческий сывороточный альбумин (Институт вакцин, Дессау), ортодианизидин (Serva, Гейдельберг), Н202 (целлулоидная фабрика, Эйленберг), сорбитовый эфир полиоксиэтилена (Serva, Гейдельберг), HCl 5 М, спектрофотометр (например, SpeKol 20, Карл Цейсс, Йена).

Методика

Полистироловые пробирки в течение ночи при 4°С инкубируют с 200 мкл анти-НВs-гамма-глобулина морской свинки (10 мг/л в ФСБ), после инкубации трижды отмывают порциями ФСБ по 600 мкл. В подготовленные таким способом пробирки добавляют по 200 мкл различных разведений стандарта или анализируемых сывороток. Пробы инкубируют 2 часа при 37°С или 16 ч при комнатной температуре, затем трижды отмывают ФСБ. Связавшийся с первыми антителами HBs-антиген на следующем этапе насыщается вторыми антителами. Для этого в пробы добавляют по 200 мкл анти-НВs-гамма-глобулина кролика (10 мг/л в ФСБ, содержащем 0,5 мМ ЧСА), снова инкубируют в течение 2 ч при 37°С, трижды отмывают ФСБ и вносят в пробы по 200 мкл антител к IgG кролика, меченых пероксидазой (1,2 мг/л ФСБ, содержащем 0,5 мМ ЧСА). Инкубируют еще 2 часа при 37°С. После троекратного отмывания ФСБ проводят ферментативную реакцию. В пробы вносят по 500 мкл субстрата (о-дианизин 0,32 мМ, Н202 0,7 мМ, сорбитовый эфир полиоксиэтилена 1,1 г/л ФСБ). Инкубируют их 2 часа при комнатной температуре, останавливают ферментативную реакцию добавлением 500 мкл 5 М НСl и измеряют экстинкцию при длине волны 535 нм в объеме 1 мл. На рисунке схематически показан ход работы.

Схема количественного определения HBs-антигена при помощи ИФЛ

Схема количественного определения HBs-антигена при помощи ИФЛ

Калибровочная кривая для определения HBs-антигена методом ИФА

Калибровочная кривая для определения HBs-антигена методом ИФА