Главная


http://karamelka-vip.ru/ салоны интим тюмень.

Получение легких и тяжелых цепей IgG

Восстановительное расщепление меркаптоэтанолом

Материалы и оборудование. Для работы необходимы IgG, 0,55 М трис-НСl-буфер с рН 8,2, меркаптоэтанол, йодацетамид (перекристаллизованный из спиртового раствора), триметиламин, 0,15 М NaCl, 1 М пропионовая кислота, сефадекс G-75, хроматографическая колонка длиной 75 см.

Расщепление.Готовят раствор IgG (20 г/л) в 0,55 М трис-НСl-буфере с рН 8,2, деаэрируют его с помощью водоструйного насоса и насыщают азотом. Добавляют меркаптоэтанол до конечной концентрации 0,75 М. Оставляют на 1 ч при комнатной температуре, затем охлаждают на ледяной бане и добавляют йодацетамид до концентрации 0,75 М. Доводят рН до 8,0 триметиламином. Выдерживают 1 час и диализуют против 0,15 М NaCl при 4°С.

Разделение легких и тяжелых цепей IgG. Восстановленный IgG диализуют против 1 М пропионовой кислоты при 4°С, после чего разделяют легкие цепи (L) и тяжелые цепи (Н) на колонке с сефадексом G-25. Н-цепи выходят в свободном объеме, второй пик соответствует легким цепям. Фракции концентрируют и проводят повторную хроматографию на сефадексе G-75 в 1 М пропионовой кислоте, после чего вновь концентрируют и проводят диализ против физиологического раствора.

Восстановительный сульфитолиз

Материалы и оборудование. Для работы нужно иметь IgG, Na2S03, CuS04·5H20, NH4C1, (NH4)2C03, концентрированный раствор аммиака, сефадекс G-25, сефадекс G-100, муравьиную кислоту, мочевину, хроматографическую колонку длиной 1 м.

Расщепление. Растворяют 0,5 г белка в 70 мл буфера с рН 8,6 (0,5 М NH4C1, рН подводят концентрированным NH3). Прибавляют 5 мл 0,1 М CuS04 и 0,1 мл концентрированного раствора аммиака. Доводят рН до 8,6, затем прибавляют буфер до объема 80 мл. Еще доливают 20 мл 1,25 М раствора Na2S03 в буфере с рН 8,6. Оставляют в закрытом сосуде на 24 ч при постоянном перемешивании. Проводят гель-фильтрацию на сефадексе G-25 в 0,25 М карбонате аммония (смена буфера) и лиофилизируют. Фракционирование легких и тяжелых цепей проводят на сефадексе G-100 в 0,05 М муравьиной кислоте с 6 М мочевиной. Получают 3 пика: IgG (агрегаты Н-цепей), тяжелые и легкие цепи.

Обсуждение

Дисульфидные мостики между цепями молекул иммуноглобулинов расщепляются меркаптоэтанолом. Для предотвращения окисления вводят йодацетамид. Восстановление дисульфидных связей происходит при конечных концентрациях меркаптоэтанола 0,2 М или даже 0,1 М. IgM восстанавливается 0,2 М меркаптоэтанолом при 4°С за 24 ч, при 30°С — за 1 ч. Эффективным восстанавливающим агентом является дитиотреитол в концентрации 0,1 М. Йодацетамид добавляют к тиоловым соединениям в молярных соотношениях 1:1, 1,1:1 или 2:1. Восстановление меркаптоэтанолом можно проводить в присутствии денатурирующих агентов (8 М мочевина, 7 М гуанидин-гидрохлорид). При этом образуются продукты, нерастворимые в буферных растворах, но растворимые в 6 М мочевине, 3 М гуанидин-гидрохлориде, 50% уксусной кислоте или 0,5—1% растворе додецилсульфата натрия. Нековалентные связи между легкими и тяжелыми цепями разрывают 1 М пропионовой или уксусной кислотой, после чего становится возможным разделение на сефадексе.

В пропионовой кислоте легкие цепи присутствуют в виде мономеров, тяжелые цепи частично агрегированы. Даже в смеси 8 М мочевина—1 М пропионовая кислота наблюдается незначительная агрегация Н-цепей. Наблюдаемая в нейтральных буферных растворах тенденция к агрегации тяжелых цепей обусловлена нековалентными связями (тиоловые группы блокированы йодацетамидом). В 0,004 М ацетатном буфере с рН 5,4 легкие и соответственно тяжелые цепи присутствуют в виде димеров. Если в этом буфере смешивать димеры L- и Н-цепей, образуются молекулы IgG, не отличимые ни методом Оухтерлони, ни ультрацентрифугированием от нативнога IgG.

Рекомбинация алкилированных L- и Н-цепей IgG в растворе пропионовой кислоты может быть осуществлена диализом против нейтрального буфера и последующей очисткой на сефадексе G-200. Возможна рекомбинация легких и тяжелых цепей различных биологических видов. Рекомбинация IgG за счет дисульфидных связей возможна только в отсутствие алкилирования после восстановления меркаптоэтанолом. Нековалентные связи между цепями не образуются, если проводить ацилирование ε-аминогруппы лизина.

Поэтому после расщепления меркаптоэтанолом и алкилирования диссоциация проходит легко и цепи хорошо отделяются друг от друга. В качестве ацилирующего агента используют малеиновый или янтарный ангидриды. Разделение молекулы IgM человека на легкие и тяжелые цепи после малеинирования, восстановления и алкилирования проводят на сефадексе G-200 в 0,01 М трис-HCl-буфере с рН 8,6, содержанием 0,1 М NaCl. L- и Н-цепи IgG кролика разделяют на сефадексе G-100 после сукцинилирования в 0,01 М трис-HCl-буфере с рН 8,2, но не при высоких концентрациях солей ввиду опасности агрегации. Расщепление дисульфидных мостиков под действием Na23 и Сu2+ протекает по следующему уравнению: 

RSSR + 2Cu2+ + 2SO32-4 ↔ 2RSS03- + 2Cu+.

Антитела IgM теряют активность после обработки меркаптоэтанолом, IgG резистентен к меркаптоэтанолу в этом отношении. Для дифференцировки IgM и IgG антитела инкубируют 1 ч при 37°С с 0,1 М меркаптоэтанолом. Затем определяют активность антител. Аналитическим ультрацентрифугированием было показано, что после восстановления IgM человека в течение 1 ч при комнатной температуре в трис-HCl-буфере с рН 8,6 и последующего алкилирования йодацетамидом образуются субъединицы IgM с константой седиментации 6,7S, состоящие из двух μ-цепей и двух легких цепей, связанных нековалентно. При низкой концентрации белка субъединицы IgM распадаются на 5S-компоненты, т. е. на «половинки» четырех цепочечных субъединиц с относительной молекулярной массой около 100 000. В одинаковых экспериментальных условиях восстановленный и алкилированный IgG не распадается на «половинки». Это может быть причиной того, что восстановленный и алкилированный IgM теряет агглютинирующую способность после восстановления. В то же время субъединицы IgM с ковалентно связанными μ- и L-цепями сохраняют агглютинирующие свойства. Следует отметить, что лимфоцитотоксические IgG мыши при низких концентрациях белка (0,3—0,7 мг/мл) оказываются до некоторой степени чувствительными к меркаптоэтанолу, однако это свойство пропадает при более высоких концентрациях IgG (20 мг/мл).

При помощи 0,1 М меркаптоэтиламина молекулу IgG кролика можно разделить на 2 субъединицы, состоящие из одной тяжелой и одной легкой цепи. Реакцию проводят в 0,1 М ацетатном буфере с рН 5,0 при 37 °С в течение 75 мин в атмосфере азота. Меркаптоэтиламин удаляют ионообменной хроматографией при рН 5,0 на холоду. Свободные SH-группы инактивируют парахлормеркурибензоатом, который затем удаляют диализом против 0,025 М NaCl.

Подкисление раствора IgM HCl до рН 2,4 вызывает диссоциацию молекулы на две половинки. Меркаптоэтиламин уже в концентрации 0,015 М вызывает частичное расщепление молекул IgG. При нейтральном рН наблюдается рекомбинация половинок в полные молекулы IgG за счет нековалентных связей. Заблокированные SH-группы можно восстановить 0,1 М меркаптоэтиламином (3 ч, 37 °С) в 0,1 М ацетатном буфере с рН 4,5. Белок очищают на сефадексе G-25, в том же буфере при рН 8,0 происходит окисление сульфгидрильных групп в дисульфидные с полным восстановлением исходной структуры.

Способность к диссоциации при рН 2,4 сохраняет только 32% молекул IgG после трехчасовой инкубации при 37°С и рН 8,0. За 30 мин инкубации при 30°С в 0,1 М трис-HCl-буфере, содержащем 0,06 М NaCl, при рН 8,0 0,02 М меркаптоэтиламин вызывает расщепление дисульфидных связей между субъединицами IgM. Окисление неалкилированных субъединиц путем диализа против 0,001 М натрий-боратного буфера, содержащего 0,16 М NaCl, с рН 8,0 при интенсивном перемешивании буфера ведет к восстановлению структуры IgM.